Aliki Zavoriti, Équipe B. Chazaud – 17 Décembre 2022

Étude du microenvironnement des cellules souches musculaires dans la cachexie cancéreuse et bénéfices d’une thérapie par électrostimulation neuromusculaire
Directeur: Julien Gondin

Thèse sous embargo

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Les propriétés des progéniteurs fibro-adipogènes dans le muscle squelettique normal en régénération et dans les myopathies dégénératives

Thèse sous embargo

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Régulation des cellules vasculaires dans la dystrophie musculaire de Duchenne

Thèse sous embargo

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Implication de l’axe SETDB1-HUSH-MORC2 dans le contrôle de la latence du virus herpes simplex 1

Le corps humain est colonisé par de nombreux microorganismes commensaux formant ainsi le microbiote humain. Le microbiote humain est désormais reconnu comme un acteur essentiel de la santé et de la physiologie de son hôte. Les efforts de description du microbiote humain ont surtout porté sur sa composante bactérienne, mais il apparaît de plus en plus évident que de nombreux virus appartiennent également à ce microbiote humain. La composante virale du microbiome humain introduit donc une notion plus récemment admise, celle du virome humain qui correspond à l’ensemble des virus détectés chez l’homme. Parmi ces virus, on retrouve la famille des Herpesvirus et notamment le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1). Ce virus persiste dans l’organisme de son hôte sous forme latente au sein des ganglions trijumeaux innervant la face. Cette latence se caractérise par l’absence de réplication du virus au moment de l’infection initiale ce qui engendre une répression transcriptionnelle du génome viral sous la pression de la réponse antivirale intrinsèque. Cependant, les épisodes de réactivations sont très fréquents. Cette réactivation entraine des manifestations cliniques variables au niveau du système nerveux périphérique et central, avec des degrés de gravité croissants allant de simples dommages épithéliaux au niveau de la face tel que le bouton de fièvre, à des kératites pouvant engendrer une cécité, mais également à des encéphalites fulgurantes ou encore être un facteur de risque de la maladie d’Alzheimer.
L’établissement de latence de HSV-1 est contrôlé par les corps nucléaires PML (PML NBs) mais leur implication exacte reste encore confuse. Une des caractéristiques majeures de la latence du virus est l’interaction entre le génome viral et les PML NBs formant des structures nommées viral DNA-containing PML- NBs (vDCP NBs). L’utilisation d’un modèle d’infection de fibroblastes primaires humains, qui reproduit la formation des vDCP NBs, combinée à une approche par immuno-FISH, a permis de montrer que les vDCP NBs contiennent l’entité SETDB1-HUSH-MORC2. Des expériences de ChIP-qPCR ont permis de démontrer l’implication de cet axe dans la mise en latence du génome HSV-1 via le dépôt de la marque chromatinienne: triméthylation de la lysine 9 de l’histone 3 (H3K9me3). Des expériences d’inactivation des différents composants de cette entité ont permis de montrer son implication dans le maintien de la latence de HSV-1, y compris dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (huiPSDN). Finalement, cette étude a permis de révéler l’axe SETDB1-HUSH-MORC2 comme un facteur de restriction chromatinien de HSV-1.

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Nouvelles perspectives sur la physiopathogénétique de l’amyotrophie spinale

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Maintenance télomérique, intérêt dans le diagnostic des gliomes en lien avec le métabolisme mitochondrial

Le complexe Shelterin, composé de 6 protéines (POT1 / TRF1 / TRF2 / TIN2 / RAP1 et ACD) joue un rôle majeur au niveau des télomères. Ainsi, il permet la protection de l’extrémité simple brin par la formation de la D-loop, la régulation de la signalisation des voies de dommages à l’ADN ; il participe à la réplication des télomères et contrôle l’accessibilité et la processivité de la télomérase, unique enzyme permettant l’allongement des télomères.
Au cours de cette thèse, mon travail s’est organisé autour de 2 principaux axes, le premier, fondamental s’est intéressé aux effets extra-télomériques de la protéine ACD (anciennement appelée TPP1). Le deuxième, plus transversal s’est attardé sur les processus de maintenance des télomères dans le cas des gliomes.
Concernant le premier aspect, il est maintenant connu que la protéine ACD fait le lien entre TIN2 et TERT (sous unité catalytique de la télomérase) aux télomères. Ces deux protéines peuvent aussi partiellement se localiser à la mitochondrie et y possèdent alors divers effets sur le métabolisme, la régulation du stress oxydant ou encore la mitophagie. Ainsi, et suite à des prédictions in silico de potentiel MTS pour ACD, nous avons émis l’hypothèse qu’ACD pourrait être le partenaire manquant de TIN2 et TERT à la mitochondrie. Dans ce cas il restait alors à identifier ses fonctions mitochondriales. Après avoir démontré la localisation partielle d’ACD à la mitochondrie par différentes méthodes, nous avons pu mettre en évidence son influence dans la protection contre le stress oxydatif. Ainsi la surexpression d’ACD réduit la production secondaire de radicaux oxygénés mitochondriaux et la perte d’ADN mitochondrial. Le stress oxydatif causant la réduction des foci mitochondriaux d’ACD. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux mécanismes de maintenance des télomères (TMM) que les cellules cancéreuses acquièrent afin d’outrepasser la sénescence réplicative. Dans ce sens, les tumeurs peuvent réactiver la télomérase (95% des cas) ou utiliser un processus alternatif (ALT) basé sur la recombinaison homologue (5% des cas). Pour les gliomes, jusqu’à 25% des tumeurs utilisent le processus ALT, associé à la perte d’ATRX, les autres gliomes utilisent la télomérase et présentent classiquement une mutation du promoteur de TERT (TERTmt). Ces deux marqueurs moléculaires ont par ailleurs une valeur diagnostique et pronostique et font parties des critères de classification histo-moléculaire de l’OMS . Or, de 4 à 28% des gliomes (selon les sous-types) ne possèdent ni altération d’ATRX ni mutation de TERT suggérant une activation de l’un des TMM par d’autres altérations voire d’autres voies. Dans ce sens, nous avons développé un test mesurant le TMM vrai en nous basant sur la recherche des c-circle (un marqueur du ALT) et proposé un algorithme breveté (TeloDiag) prenant en compte ce TMM, les mutations d’IDH et le grading histologique. Le TeloDiag permet de re-classer 38% des gliomes atypiques (au niveau moléculaire). Il a généré une nouvelle catégorie de tumeurs de haut grade IDHwt et ALT+, n’existant pas dans la classification OMS et montrant une tendance à un meilleur pronostic que les glioblastomes IDHwt (TERTmt). Enfin, nous avons apporté la preuve de concept de la faisabilité de ce test en circulant, pour les astrocytomes IDHmt.

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Rôle des corps nucléaires PML et du complexe chaperon d’histones HIRA dans la dynamique de la chromatine

Au sein du noyau des cellules eucaryotes, l’ADN s’enroule autour de protéines histones pour former une structure appelée la chromatine. Cette organisation permet notamment la compaction d’un génome de 2 mètres dans un noyau d’une dizaine de micromètres. Elle permet également de réguler l’expression des gènes. En effet, la chromatine est porteuse d’une information appelée l’information épigénétique et la modulation de sa structure peut avoir des conséquences importantes sur le programme transcriptionnel d’une cellule. Le complexe chaperon d’histones HIRA est impliqué dans le dépôt du variant d’histone H3.3 dans des régions d’euchromatine ou dans des régions dépourvues de nucléosomes afin d’assurer l’intégrité de la chromatine et de l’information épigénétique. En conditions normales, le complexe HIRA localise de façon homogène dans le noyau cellulaire ; en revanche, dans certaines conditions de stress, comme lors de l’inflammation, de l’entrée des cellules en sénescence ou, comme je l’ai montré dans ma thèse, lors de l’induction de cassures double-brin de l’ADN, le complexe HIRA s’accumule avec H3.3 dans des organelles nucléaires sphériques sans membrane appelés corps nucléaires PML. L’impact fonctionnel d’une telle accumulation est encore mal compris. Lors de ma thèse, j’ai cherché à comprendre comment et pourquoi le complexe HIRA localisait dans ces organelles. En particulier, j’ai cherché à analyser l’impact fonctionnel de cette localisation sur le dépôt d’H3.3 en des régions particulières de la chromatine.
Dans un premier temps, j’ai investigué les mécanismes et le rôle de la relocalisation de HIRA lors de l’inflammation induite en réponse de la signalisation interféron de type I (IFN-I), une cytokine pro- inflammatoire. Mes travaux ont permis de montrer que le complexe HIRA relocalise au sein des corps nucléaires PML d’une façon dépendante des interactions entre la modification SUMO et un motif d’interaction avec cette modification (SIM). De plus, j’ai montré que le complexe HIRA et les corps nucléaires PML étaient importants dans la régulation de l’expression des gènes stimulés par l’IFN-I (ISGs), en participant à l’incorporation du variant d’histone H3.3 dans ces loci géniques. Leur action pourrait permettre de mieux contrôler la réponse inflammatoire afin d’assurer son homéostasie. Dans un second temps, je me suis intéressée à la relocalisation d’HIRA dans les corps nucléaires PML induite par les cassures double-brin, jamais décrite auparavant. J’ai montré que cette relocalisation est indépendante de la signalisation IFN-I et dépend probablement de la signalisation en réponse aux dommages à l’ADN. Le recrutement d’HIRA est également dépendant d’interactions SIM-SUMO. De façon intéressante, le complexe HIRA dans les corps nucléaires PML juxtapose à proximité des sites de cassures, et cela pourrait servir à incorporer de nouvelles histones après la réparation et ainsi assurer le rétablissement de la structure chromatinienne.

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Exploiter l’épigénétique pour améliorer la fonction des cellules satellites dans la dystrophie musculaire de Duchenne

Thèse sous embargo

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Etude des cellules souches musculaires dans la dermatomyosite et les autres myosites

Les myopathies inflammatoires idiopathiques (MII) constituent un groupe hétérogène de maladies musculaires acquises. Parmi elles, la dermatomyosite (DM) est la plus fréquente, survenant à tous les âges de la vie, et pouvant engager le pronostic vital. Le diagnostic repose sur l’association d’une faiblesse musculaire, d’infiltrats inflammatoires sur la biopsie musculaire et d’auto-anticorps dans le sérum. La pathogenèse apparaît multifactorielle, avec de nombreuses études concentrées sur l’immunité adaptative, et reste à ce jour incomplètement comprise. Dans le muscle de DM, la régénération ne compense pas la nécrose, et ceci induit une évolution chronique. Néanmoins, la capacité de régénération musculaire a été très peu étudiée dans ces pathologies. Dans le muscle normal, la régénération du muscle lésé se fait par un processus de myogenèse initié par les cellules souches musculaires (CSM) et permet une réparation ad integrum du tissu lésé. L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité des CSM dérivés de DM à réaliser le processus de myogenèse. Patients et méthodes : Une sélection de patients DM (sévère et légère ) et des contrôles sains (CT ) (appariés sexe et âge) a été effectuée dans la base de données des Hospices Civils de Lyon dont les échantillons étaient disponibles en biobanque. Une étude complémentaire a été réalisés sur d’autres patients IIM : myopathie nécrosante auto-immune (MNAI) (n = 3), myosite à inclusions (IBM) (n = 3) et syndrome des anti-synthétases (SAS) (n = 3). La myogenèse a été explorée in vitro par la culture de CSM pour l’évaluation de leur prolifération, de leur différenciation en myocytes et la fusion des myocytes en myotubes. La prolifération a été évaluée par incorporation d’un analogue de la thymidine dans l’ADN. La différenciation myogénique terminale a été évaluée par l’expression cellulaire de la myogénine. La fusion cellulaire a été quantifiée comme le nombre de noyaux incorporés dans les myotubes. L’étude de la sénescence a été faite par cytométrie en flux avec un substrat fluorescent de SA-βGalactosidase, marqueur spécifique de la sénescence. Enfin, l’impact de l’inhibition de la signalisation interféron sur la myogénèse in vitro a été évalué avec un inhibiteur des kinases JAK et un anticorps bloquant. Résultats : La prolifération des CSM de DM est significativement plus faible que celle des CSM de CT (p = 0,0020). La différenciation myogénique terminale est également très altérée dans les CSM de DM sévères, et à moindre niveau dans les cellules de DM légères (p = 0,001). La fusion est significativement diminuée dans les DM avec une diminution majeure pour les DM sévères et à un degré moindre pour les CSM de DM légères (p <0,0001 pour chacun). Ces résultats ont été reproduits pour les autres IIM, sauf les ASS. Grâce à des investigations cellulaires et moléculaires complémentaires, nous avons trouvé une sénescence accrue dans les CSM de DM in vitro, et une implication potentielle de l’interféron de type I dans l’altération de la myogenèse. En effet, la myogenèse des CSM de DM a été améliorée voire restaurée par l’adjonction des inhibiteurs de la signalisation interféron. Conclusions : Ces résultats montrent que la régénération du muscle squelettique est altérée dans la DM en raison de la capacité altérée des CSM à réaliser le processus de myogenèse. Cela peut expliquer en partie les altérations musculaires et la faiblesse musculaire observées chez les patients Ces résultats soutiennent l’hypothèse d’altérations intrinsèques des propriétés des CSM dans la DM, potentiellement liées à la voie de l’interféron et participant à la pathogenèse de la maladie

 

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Rôle de la protéine HRS/HGS (Hepatocyte growth factor regulated tyrosine kinase substrate) au cours de la myogenèse : étude in vitro

La myogenèse est un mécanisme biologique à l’origine de la formation des muscles, et est induite également lors d’une blessure musculaire. Elle est orchestrée par les cellules satellites qui prolifèrent et deviennent des myoblastes capables de se différencier pour fusionner et donner naissance à des structures appelées myotubes, futurs composants des fibres musculaires néoformées lors de la réparation tissulaire. Ces étapes sont finement contrôlées par l’activation et/ou l’inhibition de facteurs de transcription myogéniques régulés par l’activation de récepteurs membranaires et des voies de signalisations associées en aval. Le processus d’endocytose régule de nombreuses voies de signalisation cellulaires en contrôlant le nombre de récepteurs fonctionnels disponibles à la surface cellulaire. Par ailleurs, de nombreuses études ont aussi révélé que des voies de signalisations pouvaient être activées sur les membranes des compartiments endosomaux. La machinerie ESCRT (endosomal Sorting Complex required for Transport) est composée de quatre sous-unités baptisées ESCRT-0 à ESCRT-III impliquées dans divers mécanismes cellulaires essentiels et notamment dans la biogenèse des compartiments endosomaux appelés corps multivésiculaires. De ce fait, la machinerie ESCRT est impliquée dans le transport, le recyclage ou la dégradation de récepteurs membranaires ubiquitinylés et par conséquent le contrôle de leur activité et des voies de signalisations qui leurs sont associées. L’implication de cette machinerie dans la régulation du processus de myogenèse reste néanmoins à ce jour non explorée. Mon travail de thèse s’est justement intéressé à caractériser le rôle de cette machinerie dans le processus de différentiation des myoblastes en myotubes. Au cours de ces quatre années, je me suis plus particulièrement intéressé à la protéine HRS/HGS (Hepatocyte growth factor Regulated tyrosine kinase Substrate) de la sous unité ESCRT-0 et à son implication lors du processus de myogenèse. Nos données expérimentales ont montré que l’expression et la distribution cellulaire de la protéine HRS/HGS étaient dynamiques au cours de la myogenèse et que son inhibition bloquait drastiquement la différenciation des myoblastes en myotubes. La recherche des mécanismes moléculaires et cellulaires associés nous a permis de mettre en évidence que l’inhibition de son expression dans les myoblastes empêchait la dégradation du récepteur à l’EGF (pour Epidermal Growth Factor) et conduisait alors à l’activation constitutive de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK. Cette activation fut associée à une perturbation de la localisation et de l’expression de facteurs de transcription pro-myogéniques impliqués dans le processus de myogenèse. Nous avons également identifié que l’absence de HRS/HGS perturbait l’activité de la GSK3ß et participait à l’inhibition de ce processus. Enfin, nos résultats ont aussi montré que l’absence de cette protéine altérait négativement la voie autophagique indispensable au bon déroulement de la myogenèse. De façon collective, nos résultats montrent donc pour la première fois que la protéine HRS/HGS est un facteur central, multimodal et essentiel dans la régulation du processus de myogenèse.

 

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Identification of new regulators of myonuclei positioning during skeletal muscle fibers development

Skeletal muscle fibers are built from fusion of myoblasts allowing the formation of myotubes. Those syncytia contain hundreds of nuclei that undergo many movements, simultaneously with myotubes maturation process, until reaching a final peripheric localization in mature fibers (myofibers). Disorganization of nuclei disposal is always associated with myofibers misfunctioning (i.e.: sarcopenia, centronuclear myopathy). Peripheral nuclei positioning in mature fiber appears to be essential for their functionality. Understanding the process of nuclei positioning turned up as key point.
Involvement of molecular motors are known in spacing myonuclei in the first steps of muscle differentiation, however the role of microtubules associated proteins (Maps) is less described. Consequently, identify new Maps involved in nuclei positioning during muscle formation may 1) provide a better understanding of muscle differentiation; 2) bring to light new targets potentially involved in pathologies presenting nuclei mispositioning.
In this context, my thesis work consisted in identifying proteins linked to microtubules, directly or indirectly, and involved in the regulation of myonuclei positioning throughout skeletal muscle fibers differentiation. Proteomes associated to microtubules and differentially expressed during muscle differentiation were identified using a mass-spectrometry analysis. Based on this identification, 239 proteins from the total cellular extracts of myotubes and myofibers; and 240 proteins identified in proteomes linked to microtubules were selected. A siRNA screen was performed on primary myotubes in order to decipher the involvement of those selected targets in myonuclei positioning during the first steps of muscle differentiation. This siRNA screen allowed the identification of three proteins which roles on myonuclei positioning appeared to be crucial.
Unexpectedly, we identified a cytoplasmic role of the mitotic protein NuMA1 in muscle biology field. This protein progressively accumulates into the cytoplasm where it stabilizes microtubule network in differentiating myofibers. This cytoplasmic fraction of NuMA1 proteins, in association with the dynein, regulates microtubule network architecture and myonuclei spacing. Its role is also crucial in maintaining peripherized myonuclei in mature myofibers and in neuromuscular junction regions.

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Remaniements chromosomiques complexes : de la caractérisation aux conséquences fonctionnelles

La cytogénétique humaine est une discipline visant à l’étude de la structure et de la fonction des chromosomes de notre espèce. Au début des années 2010, le séquençage de génome a révélé des remaniements chromosomiques d’une complexité encore inconnue, dénommés chromoanagenesis. Si une importante proportion de génomes tumoraux présentent ce type d’anomalies, les descriptions de cas constitutionnels sont rares et les mécanismes sous-jacents mal compris. Nous rapportons ici le séquençage de génome de 20 nouveaux cas de chromoanagenesis constitutionnels (6 équilibrés et 14 déséquilibrés), constituant la plus large cohorte à ce jour. Chez plusieurs patients, des loci de moins d’un kilobase apparaissent plusieurs fois dans le remaniement dans ce que nous nommons un « hub ». L’étude de la distribution des points de cassure de ces chromoanagenesis et de ceux de la littérature a montré que la réplication tardive de la chromatine était le « facteur de risque » principal de cassure chromosomique. Ce résultat vient apporter une démonstration orthogonale à l’hypothèse de condensation prématurée d’un chromosome à l’origine de ces remaniements et montre pour la première fois une origine commune aux chromoanagenesis constitutionnels et tumoraux. Parallèlement, la distribution des points de cassure de remaniements simples apparaît biaisée vers le centre du noyau ouvrant d’importantes voies de recherche. Pour mieux comprendre les conséquences de ces remaniements complexes sur le fonctionnement du génome nous avons étudié le transcriptome des 6 cas de chromoanagenesis équilibrés. Nous n’avons pas mis en évidence de dérégulation massive du génome. Même localement, à proximité des points de cassure, il n’apparaît pas de dérégulation de l’expression génique posant là encore d’importantes questions sur les mécanismes de « résistance » aux remaniements.
La détection de remaniements chromosomiques n’est aujourd’hui (presque) plus limitée par la technologie (séquençage short-read, long-read, linked-read, cartographie optique). La compréhension des mécanismes à leur origine, la connaissance de leur pouvoir pathogène et plus généralement la maîtrise de la biologie du génome sont les nouvelles limites à la corrélation génotype/phénotype. Par l’étude des chromoanagenesis, d’un exceptionnel transcrit de fusion chez un patient hémophile et la description d’éléments transposables méconnus (rétrocopies) nous apportons d’importants nouveaux éléments.

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Rôle de la sélénoprotéine P et de la glutathion peroxydase 3 dans le phénotype des macrophages et la régénération musculaire
Directeur: Rémi Mounier

Après une lésion musculaire, la réparation du tissu est régulée par différentes cellules et notamment par les macrophages qui orchestrent à la fois la réponse inflammatoire et la résolution de l’inflammation, permettant la régénération tissulaire. Après une lésion, les macrophages pro-inflammatoires activent la prolifération des cellules myogéniques et phagocytent les débris cellulaires. Ce processus cellulaire promeut l’activation d’un état anti- inflammatoire des macrophages qui stimule la fusion des cellules myogéniques. Les effecteurs grâce auxquels les macrophages anti-inflammatoires ont des effets pro-myogéniques sont peu décrits. Grâce à un transcriptome/sécrétome comparant les protéines sécrétées par les macrophages humains pro et anti-inflammatoires, nous avons identifié deux molécules antioxydantes : la sélénoprotéine P (SEPP1) et la glutathion peroxydase 3 (GPX3) dont les fonctions restent faiblement caractérisées dans la biologie musculaire et l’inflammation. Nos résultats montrent que GPX3 et SEPP1 sont impliqués dans la fonction anti-inflammatoire des macrophages, dans la stimulation des dernières étapes de la myogenèse. In vivo, ces deux sélénoprotéines sont nécessaires à l’homéostasie du muscle squelettique. En utilisant un modèle de lésion du muscle squelettique d’animaux dépourvus de sélénoprotéine dans les macrophages (modèle LysMCre/+ Sepp1fl/fl), nous avons constaté que l’absence de SEPP1 perturbe le passage d’un phénotype pro-inflammatoire vers un phénotype anti-inflammatoire au cours de la régénération musculaire.
Ainsi, nous avons mis en évidence pour la première fois le rôle des sélénoprotéines sécrétées par les macrophages dans la réparation des tissus, établissant un lien entre molécules antioxydantes et résolution de l’inflammation.

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Investigating sarcoplasmic reticulum function during skeletal muscle excitation-contraction coupling using fluorescent biosensors

Excitation-contraction (EC) coupling in skeletal muscle corresponds to the sequence of events through which muscle fiber contraction is triggered in response to plasma membrane electrical activity. EC coupling takes place at the triads; these are nanoscopic domains in which the transverse invaginations (t-tubules) of the surface membrane are in close apposition with two adjacent terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. More precisely, EC coupling starts with action potentials fired at the endplate, propagating throughout the surface membrane and in depth into the muscle fiber through the t-tubules network. When reaching the triadic region, action potentials activate the voltage-sensing protein Cav1.1. In turns, Cav1.1 directly opens up the type 1 ryanodine receptor (RYR1) in the immediately adjacent SR membrane, through intermolecular conformational coupling. This triggers RYR1-mediated SR Ca2+ release which produces an increase in cytosolic Ca2+ triggering contraction.
Current understanding of the mechanisms involved in the control and regulation of RYR1 channels function is still limited. One reason is related to the fact that detection of RYR1 channel activity in intact muscle fibers is only achieved with indirect methods. Also, whether the SR membrane voltage experiences changes during muscle activity has so far never been experimentally assessed. Yet, deeper knowledge of these processes is essential for our understanding of muscle function in normal and disease conditions.
In this context, the general aim of my PhD project was to design and use fluorescent protein biosensors specifically localized at the SR membrane of differentiated muscle fibers, by fusing them to an appropriate targeting sequence. Thanks to a combination of single cell physiology and biophysics techniques based on electrophysiology and biosensor fluorescence detection, we were able to study the SR activity during muscle fiber function. Specifically, my PhD work focused on two major issues: SR membrane voltage and SR calcium signaling during EC coupling.
The first aim of my work was to characterize SR membrane voltage changes during muscle fiber activity. For this, we used voltage sensitive FRET-biosensors of the Mermaid family. Results show that the SR trans-membrane voltage experiences no substantial change during EC coupling. This provides the first experimental evidence, in physiological conditions, for the existence of ion counter-fluxes that balance the charge deficit associated with RYR1-mediated SR Ca2+ release. Indeed, this process is essential for maintaining the SR Ca2+ flux upon RYR1 channels opening and thus critically important for EC coupling efficiency.
The second objective of my work aimed at detecting the changes in Ca2+ concentration occurring in the immediate vicinity of the RYR1 Ca2+ release channels during muscle fiber activation. For this, we took advantage of one member of the recent generation of genetically encoded Ca2+ biosensors: GCaMP6f. The SR-targeted biosensor provides a unique access to the individual activity of RYR1 channels populations within distinct triads of a same muscle fiber. Beyond allowing a detailed characterization of the biosensor properties in this preparation, results highlight the remarkable uniformity of SR Ca2+ release activation from one triad to another, during EC coupling. These results open up stimulating perspectives for the investigation of disease conditions associated with defective behavior of RYR1 channels.

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Interactions entre le Récepteur aux glucocorticoïdes et l’AMP-activated protein kinase dans les macrophages au cours de la régénération du muscle strié squelettique
Directeurs: Rémi Mounier & Bénédicte Chazaud

Le muscle strié squelettique régénère ad integrum après une lésion aigüe stérile grâce aux cellules satellites qui sont les cellules souches du muscle strié squelettique. L’inflammation, et notamment les macrophages, joue un rôle important durant ce processus. En effet, après une lésion, les monocytes sanguins infiltrent le tissu et deviennent des macrophages avec un phénotype pro-inflammatoire associé à la lésion. Ces macrophages phagocytent les débris cellulaires et promeuvent la prolifération des cellules souches musculaires. Ensuite, les macrophages changent leur phénotype vers un phénotype anti-inflammatoire associé à la restauration du tissu. Ils promeuvent la différenciation, puis la fusion des cellules souches musculaires et la croissance des myofibres. Cette séquence de phénotypes inflammatoires est essentielle pour une régénération musculaire efficace. Le laboratoire a montré que ce changement de phénotype est dépendant d’un senseur énergétique majeur de la cellule qui contrôle le métabolisme cellulaire, l’AMP kinase (AMPK)α1. Par ailleurs, les glucocorticoïdes sont utilisés depuis des décennies pour leurs effets anti-inflammatoires sur l’inflammation. Leur action est médiée par le Récepteur aux Glucocorticoïdes qui induit ou réprime l’expression de gènes par interaction directe ou indirecte sur l’ADN. Comme l’AMPKα1 et les glucocorticoïdes induisent des effets anti- inflammatoires similaires sur les macrophages, nous avons posé l’hypothèse que ces 2 voies de signalisation pourraient être interconnectées dans les macrophages afin de permettre leur changement de phénotype au cours de la régénération musculaire. Les données issues d’un modèle in vitro de lésion musculaire utilisant des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris ont montré que : i) les glucocorticoïdes induisaient la phosphorylation de l’AMPKα1 ; ii) l’AMPKα1 était requise pour l’acquisition fonctionnelle du statut anti-inflammatoire des macrophages induit par les glucocorticoïdes puisque des macrophages déficients pour l’AMPKα1 ne modifiaient pas leur phénotype et ne stimulaient pas la myogenèse. Les expériences in vivo utilisant des souris LysMCre/+;AMPKα1fl/fl dans lesquelles l’AMPKα1 est invalidée uniquement dans les cellules myéloïdes ont montré que l’AMPK dans les macrophages régulait les effets bénéfiques des glucocorticoïdes au cours de la régénération du muscle strié squelettique. En effet, en absence d’AMPK dans les macrophages, les GCs induisaient un retard de régénération et une modification de la maturation des fibres attestée par une modification de l’expression des chaînes lourdes de myosines. En conclusion, ces données montrent que l’AMPKα1 est requise pour le changement de phénotype des macrophages induit par les glucocorticoïdes afin de permettre la régénération musculaire.

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Nucleotide Excision Repair at the crossroad with transcription

The integrity of DNA is continuously challenged by a variety of endogenous and exogenous agents (e.g. ultraviolet light, cigarette smoke, environmental pollution, oxidative damage, etc.) that cause DNA lesions which interfere with proper cellular functions. Nucleotide Excision Repair (NER) mechanism removes helix-distorting DNA adducts such as UV-induced lesions and it exists in two distinct sub-pathways depending where DNA lesions are located within the genome. One of these sub pathways is directly linked to the DNA transcription by RNA Polymerase 2 (TCR). In the first part of this work, we demonstrated that a fully proficient NER mechanism is also necessary for repair of ribosomal DNA, transcribed by RNA polymerase 1 and accounting for the 60 % of the total cellular transcription. Furthermore, we identified and clarified the mechanism of two proteins responsible for the UV-dependent nucleolar repositioning of RNAP1 and rDNA observed during repair. In the second part of this work, we studied the molecular function of the XAB2 protein during NER repair and we demonstrated its involvement in the TCR process. In addition, we also shown the presence of XAB2 in a pre-mRNA splicing complex. Finally, we described the impact of XAB2 on RNAP2 mobility during the first steps of TCR repair, thus suggesting a role of XAB2 in the lesion recognition process.

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Utilisation de la matrice extracellulaire comme biomatériaux pour optimiser la régénération musculaire

Le muscle strié squelettique possède de grandes capacités de régénération grâce à ses cellules souches, les cellules satellites. Après une lésion, le processus de régénération musculaire qui se met en place est finement régulé dans le temps et l’espace par le microenvironnement, constitué de cellules avoisinantes mais également par des éléments de la matrice extracellulaire (MEC). Cette dernière se compose de molécules structurales comme les collagènes et de composants possédant un rôle trophique comme les glycosaminoglycanes (GAGs). La MEC musculaire est peu étudiée à cause d’une organisation tridimensionnelle complexe rendant son exploration difficile. Lors d’une lésion avec perte de substance musculaire, la régénération est altérée, associée à une fibrose et une inflammation chronique. Ce type de lésion est fréquemment rencontré en traumatologie mais survient également chez le blessé de guerre. Malgré un traitement optimal, une invalidité fonctionnelle persiste chez ces patients. L’utilisation d’un biomatériau décellularisé, constitué de MEC pourrait fournir ce support physique et trophique faisant défaut dans ce type de lésion. Dans ce travail, nous avons entrepris l’établissement d’une MEC d’origine musculaire et nous avons établi un protocole de décellularisation permettant d’obtenir un biomatériau conservant l’architecture spécifique de la MEC musculaire avec une élimination de la majorité des antigènes cellulaires afin d’éviter une réponse immunitaire délétère après implantation. Néanmoins, le protocole retenu ne permet de conserver certaines molécules trophiques d’intérêt comme les GAGs. Les « ReGeneRaTing Agent®» (RGTA®) sont des mimétiques fonctionnels de ces GAGs, utilisés en clinique pour améliorer la cicatrisation cutanée et cornéenne. Ces mimétiques conservent une capacité de liaison aux facteurs de croissance avec une résistance aux dégradations enzymatiques. Nous avons évalué l’utilisation de ces molécules au cours de la réparation musculaire, dans un modèle in vivo chez le rongeur. Nous avons réalisé une analyse histologique précoce (8e jour de régénération) mettant en évidence une augmentation du nombre de noyaux par myofibre en faveur d’une augmentation de la fusion, validée également in vitro sur des progéniteurs musculaires. Nous avons également observé une augmentation du nombre de vaisseaux, suggérant une amélioration de l’angiogenèse. Le nombre de gouttelettes lipidiques, marqueur d’une mauvaise régénération, était en diminution. L’exploration histologique plus tardive (28e jour de régénération) n’a retrouvé que l’augmentation du nombre de vaisseaux en faveur d’un effet durable sur l’angiogenèse. Ces RGTA® peuvent être couplés aux biomatériaux et sont particulièrement résistants dans un environnement inflammatoire pouvant être rencontré dans les lésions avec perte de substance musculaire. Des chimiokines et des facteurs de croissance pourront également être ajoutés au biomatériau matriciel afin de favoriser la migration des différents progéniteurs nécessaires à une néoformation musculaire. L’efficacité thérapeutique de ces biomatériaux optimisés nécessitera d’être évaluée dans un modèle in vivo de perte de substance

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Rôle du métabolisme sur le devenir des cellules souches musculaires et l’homéostasie du muscle squelettique
Directeur: Rémi Mounier

Durant la régénération du muscle suite à une lésion, les cellules souches musculaires, aussi appelées les cellules satellites, quittent leur état de quiescence et s’activent. Elles pourront soit emprunter la voie de la myogenèse afin de former de nouvelles fibres musculaires, soit retourner à leur état de quiescence pour reformer la réserve de cellules souches mobilisable en cas de lésion ultérieure. La régulation du devenir de la cellule souche est modulée par de nombreuses voies de signalisation telles que la voie Wnt, la voie Notch ou la voie des TGFß. Cependant, rares sont les données concernant l’implication du métabolisme sur le devenir de la cellule souche. Pourtant il a été démontré que l’activation des cellules satellites est étroitement liée avec le métabolisme cellulaire, dont l’un des principaux acteurs est la protéine kinase AMPK. Ce complexe hétérotrimérique, composé de trois sous-unités α, ß et 𝜸, et est responsable de l’équilibre entre consommation énergétique et production d’énergie au sein de la cellule. Grâce à la modulation de mTORC1, il a également été prouvé que l’AMPKα1 était responsable de la croissance cellulaire et de la prolifération des précurseurs myogéniques. A l’aide de différents modè les murins, de ligné es primaires et de cellules satellites en sortie de tri, nous avons déterminé le rôle que pouvait jouer chacun des isoformes, AMPKα1 et AMPKα2 au sein de la cellule souche, sur le déroulement de la myogenèse adulte post-lésionnelle ainsi que sur l’homéostasie du muscle régénéré. Dans un premier temps nous avons démontré que la voie de signalisation AMPK 1-LDH permettait de réguler l’autorenouvellement des cellules satellites grâce au contrôle du métabolisme. En effet, au moment de l’entrée de la cellule dans la voie de la différenciation, la voie de l’AMPK 1 induit une diminution de l’activité de la LDH, permettant aux cellules d’adopter un métabolisme de phosphorylation oxydative répondant à leurs besoins énergétiques. Dans un second temps, nous avons démontré que l’isoforme AMPKα2, exprimé uniquement après l’entrée de la cellule dans la voie de la myogenèse, était responsable d’une modulation de la régénération musculaire et que son absence induisait un dé faut de différenciation et un retard de maturation des fibres néoformées. Nos travaux nous ont ainsi permis de confirmer la place centrale de la proté ine kinase AMPK dans la modulation via le mé tabolisme du devenir de la cellule souche musculaire dans un contexte de régénération du tissu musculaire squelettique dans un modè le murin.

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Epigenetic regulation of skeletal muscle differentiation
Directeur de thèse: Laurent Schaeffer

LSD1 and PHF2 are lysine de-methylases that can de-methylate both histone proteins, influencing gene expressionand non-histone proteins, affecting their activity or stability. Functional approaches using Lsd1or Phf2 inactivation in mouse have demonstrated the involvement of these enzymes in the engagement of progenitor cells into differentiation.
One of the best-characterized examples of how progenitor cells multiply and differentiate to form functional organ is myogenesis. It is initiated by the specific timing expression of the specific regulatory genes; among these factors, MYOD is a key regulator of the engagement into differentiation of muscle progenitor cells. Although the action of MYOD during muscle differentiation has been extensively studied, still little is known about the chromatin remodeling events associated with the activation of MyoDexpression. Among the regulatory regions of MyoDexpression, the Core Enhancer region (CE), which transcribes for a non-coding enhancer RNA (CEeRNA), has been demonstrated to control the initiation of MyoDexpression during myoblast commitment.
We identified LSD1 and PHF2 as key activators of the MyoDCE. In vitroand in vivoablation of LSD1 or inhibition of LSD1 enzymatic activity impaired the recruitment of RNA PolII on the CE, resulting in a failed expression of the CEeRNA. According to our results, forced expression of the CEeRNA efficiently rescue MyoDexpression and myoblast fusion in the absence of LSD1. Moreover PHF2 interacts with LSD1 regulating its protein stability. Indeed in vitroablation of PHF2 results in a massive LSD1 degradation and thus absence of CEeRNA expression. However, all the histone modifications occurring on the CE region upon activation cannot be directly attributed to LSD1 or PHF2 enzymatic activity.
These results raise the question of the identity of LSD1 and PHF2 partners, which co-participate to CEeRNA expression and thus to the engagement of myoblast cells into differentiation.

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Devenir de l’ADN ribosomique et de l’ARN polymérase I lors de la réparation des lésions induites par les UV

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